آشنایی با روش های استخراج سلول RNA + ویدیو (2 نکته مهم)
همه چیز درباره RNA
تکثیر microRNA با استفاده از روش Real-time PCR یکی از تکنیک‌های مهم و پرکاربرد در تحقیقات مرتبط با microRNA است. این روش برخلاف روش‌های سنتی Real-time PCR، به خاطر اندازه کوچک microRNA ها نیاز به تکنیک‌های خاصی دارد.
یکی از این تکنیک‌ها افزودن یک دم polyA به miRNAهای مورد نظر است. در کیت PARSGENOME MiR-Amp kit نیز از همین روش برای تکثیر miRNAها بهره برده شده است.
استخراج RNA یکی از مراحل کلیدی در تحقیقات مربوط به miRNA می‌باشد. روش‌های مختلفی برای استخراج RNA وجود دارد، اما تنها برخی از آن‌ها قابلیت حفظ و استخراج RNA های کوچک مولکول را دارند.
دستورالعمل زیر توسط تیم تحقیقاتی ما برای استخراج RNA کامل که شامل miRNA است، بهینه‌سازی و آزمایش شده است. این دستورالعمل برای محلول‌های استخراج پایه گوانیدین ایزوتیوسیانات-فنل: کلروفرم قابل استفاده است.
استخراج RNA برای خالص‌سازی RNA از نمونه‌های سلولی و بافت انجام می‌شود. به دلیل وجود آنزیم‌های ریبونوکلئاز، این روش بسیار پیچیده و سخت است. بنابراین توصیه می‌شود قبل از شروع کار، همه وسایل با محلول‌های خنثی‌کننده RNase مانند DEPC شسته شوند و تمام مراحل در زیر هود و با دستکش انجام گیرد.
RNA چیست؟
تمامی موجودات زنده پیشرفته روی زمین از سه نوع مولکول زیستی برای مدیریت فعالیت‌های حیاتی در سلول‌های خود استفاده می‌کنند.
پروتئین‌ها عملکردهای مختلفی در سلول دارند، مانند ایجاد ساختار، انتقال مواد شیمیایی در داخل سلول و انجام فعالیت‌های کاتالیزی. در عوض، اسیدهای نوکلئیک (DNA و RNA حامل اطلاعات ژنتیکی هستند) و می‌توانند از نسلی به نسل دیگر به ارث برسند.
RNA مخفف ribonucleic acid (اسید ریبونوکلئیک) است، این یک مولکول پلیمری است که از یک یا چند نوکلئوتید تشکیل شده است. می‌توان یک رشته RNA را مانند یک زنجیره در نظر گرفت که در هر نقطه از آن، یک نوکلئوتید قرار دارد.
هر نوکلئوتید از چهار نوع پایه (آدنین، سیتوزین، گوانین و اوراسیل) تشکیل شده است که به آن‌ها به اختصار A، C، G و U نیز می‌گویند. هر نوکلئوتید همچنین شامل یک قند ریبوز و یک گروه فسفات است.
روش‌های استخراج RNA
چندین روش برای استخراج RNA وجود دارد که در زیر به بعضی از آن‌ها اشاره می‌شود:
1. روش فنل_کلروفرم ۱
چندین“`html
برای استخراج RNA روش‌های مختلفی وجود دارد و یکی از مهم‌ترین آن‌ها روش فنل _ کلروفرم است. این روش به نوعی استخراج مایع-مایع محسوب می‌شود که برای خالص‌سازی اسیدهای نوکلئیک و حذف پروتئین‌ها و چربی‌ها استفاده می‌شود.
2. روش فنل _ کلروفرم ۲
در این روش، بافت‌های همگن، سلول‌های شکسته شده و نمونه‌های مایع با حجم یکسانی از فنل و کلروفرم ترکیب می‌شوند و پس از فرآیند سانتریفوژ، دو لایه مجزای مایع یکی آبی و دیگری آلی تشکیل می‌شود.
پروتئین‌ها و چربی‌های هیدروفوب (دشوار برای حل شدن در آب) در لایه آلی قرار می‌گیرند و در لایه آبی، اسیدهای نوکلئیک و سایر مواد مزاحم مانند نمک و قند وجود دارند. هنگام جداسازی لایه آبی باید بسیار دقت کنید تا از لایه آلی، به‌ویژه بخش بالایی آن که حاوی پروتئین‌هاست، اجتناب کنید.
3. روش فنل _ کلروفرم ۳
مقدار pH محلول برای خالص‌سازی RNA از DNA بسیار اهمیت دارد. در شرایط اسیدی، DNA به لایه آلی منتقل می‌شود و RNA در لایه آبی باقی می‌ماند، اما در شرایط قلیایی، هر دو در لایه آبی باقی می‌مانند.
4. روش فنل _ کلروفرم ۴
با استفاده از ایزوپروپانول، RNA رسوب می‌کند و در مرحله نهایی، با اتانول ۷۰%-۸۰% شستشو و خالص‌سازی انجام می‌شود. در نهایت رسوب RNA در مقداری آب بدون RNase حل می‌شود.
تفاوت میان RNA و DNA
ساختار نوکلئوتیدهای RNA بسیار شبیه ساختار نوکلئوتیدهای DNA است، اما یک تفاوت اصلی وجود دارد: اسکلت RNA از قند ریبوز تشکیل شده و دارای گروه هیدروکسیل (-OH) است، در حالی که DNA این گروه را ندارد.
به همین علت هم به DNA این نامگذاری انجام شده است: دئوکسی‌ریبونوکلئیک اسید (deoxyribonucleic acid). تفاوت دیگر در این است که DNA از باز تیمین (T thymine) استفاده می‌کند، در حالی که RNA به جای آن اوراسیل (U) دارد. اگرچه ساختار RNA و DNA بسیار شبیه هم است، اما RNA در سلول‌های پیشرفته وظایف متفاوتی دارد.
در مسیر تبدیل DNA به پروتئین که به عنوان یک اصل مرکزی در زیست مولکولی شناخته می‌شود، RNA نقش مهمی ایفا می‌کند. اطلاعات ژنتیکی موجودات زنده به صورت یک زنجیره متوالی از بازها در DNA موجود در سلول کدگذاری شده‌اند.
در فرآیند رونویسی (اولین گام در بیان ژن)، یک RNA که یک کپی از DNA است، یا RNA پیامی ساخته می‌شود. این رشته RNA می‌تواند توسط ریبوزوم خوانده شده و پروتئین تولید کند.
علاوه بر این، RNAها نقش مهمی در سنتز پروتئین (در بخش ریبوزیم) و تنظیم ژن دارند. پیچ و تاب خوردن RNA به دلیل تعاملات بازها برای جفت شدن در نقاط مختلف یک رشته RNA اتفاق می‌افتد.
این انیمیشن نشان می‌دهد که چگونه پیچ و تاب خوردن RNA می‌تواند به صورت یک مدل نظری انجام شود. ساختار نشان‌داده شده، کلاس 1 RNA لیگاز (PDB #1QXI) است که توسط گروه بارتل در MIT جدا شده است.
تفاوت اصلی دیگر بین RNA و DNA این است که به طور معمول DNA به شکل دو رشته به هم تابیده در سلول وجود دارد، در حالی که RNA معمولاً به صورت یک رشته تکی است (مانند شکل بالا). عدم وجود یک جفت رشته در RNA به آن اجازه می‌دهد که به ساختارهای پیچیده‌ای سه‌بعدی پیچ بخورد.
پیچ و تاب خوردن RNA به واسطه تعاملات بازها اتفاق می‌افتد، همانطور که در DNA نیز دیده می‌شود، با این تفاوت که در RNA پیوندها به واسطه یک رشته شکل می‌گیرند، در حالی که در DNA این پیوندها توسط دو رشته ایجاد می‌شوند.
سایت رضیم
“`
